Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Používáte verzi prohlížeče s omezenou podporou CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Abychom zajistili trvalou podporu, zobrazujeme web bez stylů a JavaScriptu.
Zobrazí karusel tří snímků najednou.Pomocí tlačítek Předchozí a Další můžete procházet třemi snímky najednou nebo pomocí tlačítek posuvníku na konci procházet třemi snímky najednou.
S vývojem nových ultra měkkých materiálů pro lékařské přístroje a biomedicínské aplikace je komplexní charakterizace jejich fyzikálních a mechanických vlastností důležitá a náročná.K charakterizaci extrémně nízkého povrchového modulu nové biomimetické silikon-hydrogelové kontaktní čočky lehfilcon A byla použita modifikovaná nanoindentační technika mikroskopie atomární síly (AFM) potažená vrstvou struktur rozvětvených polymerních kartáčků.Tato metoda umožňuje přesné stanovení kontaktních bodů bez účinků viskózní extruze při přibližování k rozvětveným polymerům.Navíc umožňuje stanovit mechanické vlastnosti jednotlivých kartáčových prvků bez vlivu poroelasticity.Toho je dosaženo výběrem sondy AFM s takovou konstrukcí (velikost hrotu, geometrie a tuhost pružiny), která je zvláště vhodná pro měření vlastností měkkých materiálů a biologických vzorků.Tato metoda zlepšuje citlivost a přesnost pro přesné měření velmi měkkého materiálu lehfilcon A, který má extrémně nízký modul pružnosti na povrchu (až 2 kPa) a extrémně vysokou elasticitu ve vnitřním (téměř 100%) vodném prostředí. .Výsledky povrchové studie nejenže odhalily vlastnosti ultra měkkého povrchu čočky lehfilcon A, ale také ukázaly, že modul rozvětvených polymerových kartáčků byl srovnatelný s modulem křemíkovo-vodíkového substrátu.Tato technika charakterizace povrchu může být aplikována na další ultra měkké materiály a lékařské přístroje.
Mechanické vlastnosti materiálů určených pro přímý kontakt s živou tkání jsou často určovány biologickým prostředím.Dokonalá shoda těchto vlastností materiálu pomáhá dosáhnout požadovaných klinických charakteristik materiálu, aniž by došlo k nežádoucím buněčným reakcím1,2,3.U objemových homogenních materiálů je charakterizace mechanických vlastností relativně snadná díky dostupnosti standardních postupů a zkušebních metod (např. mikroindentace4,5,6).U ultraměkkých materiálů, jako jsou gely, hydrogely, biopolymery, živé buňky atd., však tyto zkušební metody obecně nejsou použitelné kvůli omezení rozlišení měření a nehomogenitě některých materiálů7.Tradiční indentační metody byly v průběhu let modifikovány a přizpůsobeny tak, aby charakterizovaly širokou škálu měkkých materiálů, ale mnoho metod stále trpí vážnými nedostatky, které omezují jejich použití8,9,10,11,12,13.Nedostatek specializovaných zkušebních metod, které dokážou přesně a spolehlivě charakterizovat mechanické vlastnosti superměkkých materiálů a povrchových vrstev výrazně omezuje jejich použití v různých aplikacích.
V naší předchozí práci jsme představili kontaktní čočku lehfilcon A (CL), měkký heterogenní materiál se všemi ultra měkkými povrchovými vlastnostmi odvozenými z potenciálně biomimetických vzorů inspirovaných povrchem rohovky oka.Tento biomateriál byl vyvinut naroubováním rozvětvené, zesíťované polymerní vrstvy poly(2-methakryloyloxyethylfosforylcholinu (MPC)) (PMPC) na silikonový hydrogel (SiHy) 15 určený pro zdravotnické prostředky na bázi.Tento proces roubování vytváří na povrchu vrstvu sestávající z velmi měkké a vysoce elastické rozvětvené polymerní kartáčové struktury.Naše předchozí práce potvrdila, že biomimetická struktura lehfilconu A CL poskytuje vynikající povrchové vlastnosti, jako je zlepšená prevence smáčení a znečištění, zvýšená kluznost a snížená adheze buněk a bakterií15,16.Kromě toho použití a vývoj tohoto biomimetického materiálu také naznačuje další rozšíření na další biomedicínská zařízení.Proto je zásadní charakterizovat povrchové vlastnosti tohoto ultraměkkého materiálu a porozumět jeho mechanické interakci s okem, aby bylo možné vytvořit komplexní znalostní základnu pro podporu budoucího vývoje a aplikací.Většina komerčně dostupných SiHy kontaktních čoček je složena z homogenní směsi hydrofilních a hydrofobních polymerů, které tvoří jednotnou strukturu materiálu17.Bylo provedeno několik studií, které zkoumaly jejich mechanické vlastnosti pomocí tradičních zkušebních metod v tlaku, tahu a mikroindentaci18,19,20,21.Avšak nový biomimetický design lehfilconu A CL z něj dělá jedinečný heterogenní materiál, ve kterém se mechanické vlastnosti struktur rozvětvených polymerních kartáčů výrazně liší od vlastností základního substrátu SiHy.Proto je velmi obtížné přesně kvantifikovat tyto vlastnosti pomocí konvenčních a indentačních metod.Slibná metoda využívá nanoindentační testovací metodu implementovanou v mikroskopii atomárních sil (AFM), metodu, která byla použita ke stanovení mechanických vlastností měkkých viskoelastických materiálů, jako jsou biologické buňky a tkáně, a také měkkých polymerů22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.V nanoindentaci AFM jsou základy testování nanoindentace kombinovány s nejnovějšími pokroky v technologii AFM, aby byla zajištěna zvýšená citlivost měření a testování široké škály přirozeně superměkkých materiálů31,32,33,34,35,36.Kromě toho tato technologie nabízí další důležité výhody díky použití různých geometrií.indentor a sonda a možnost testování v různých kapalných médiích.
AFM nanoindentaci lze podmíněně rozdělit do tří hlavních složek: (1) zařízení (senzory, detektory, sondy atd.);(2) parametry měření (jako je síla, posun, rychlost, velikost rampy atd.);(3) Zpracování dat (korekce základní linie, odhad bodu dotyku, přizpůsobení dat, modelování atd.).Významným problémem této metody je, že několik studií v literatuře využívající nanoindentaci AFM uvádí velmi odlišné kvantitativní výsledky pro stejný typ vzorku/buňky/materiálu37,38,39,40,41.Například Lekka a spol.Byl studován a porovnáván vliv geometrie AFM sondy na naměřený Youngův modul vzorků mechanicky homogenního hydrogelu a heterogenních buněk.Uvádějí, že hodnoty modulu jsou vysoce závislé na výběru konzoly a tvaru hrotu, s nejvyšší hodnotou pro sondu ve tvaru pyramidy a nejnižší hodnotou 42 pro kulovou sondu.Podobně Selhuber-Unkel a kol.Bylo ukázáno, jak rychlost indentoru, velikost a tloušťka indentoru vzorků polyakrylamidu (PAAM) ovlivňuje Youngův modul měřený nanoindentací ACM43.Dalším komplikujícím faktorem je nedostatek standardních zkušebních materiálů s extrémně nízkým modulem a bezplatných zkušebních postupů.Proto je velmi obtížné získat přesné výsledky s jistotou.Metoda je však velmi užitečná pro relativní měření a srovnávací hodnocení mezi podobnými typy vzorků, například pomocí AFM nanoindentace k rozlišení normálních buněk od rakovinných buněk44,45.
Při testování měkkých materiálů pomocí nanoindentace AFM je obecným pravidlem použít sondu s nízkou konstantou pružiny (k), která se přesně shoduje s modulem vzorku, a polokulovým/kulatým hrotem, aby první sonda neprorazila povrchy vzorku na první kontakt s měkkými materiály.Je také důležité, aby signál vychýlení generovaný sondou byl dostatečně silný, aby byl detekován systémem laserového detektoru24,34,46,47.V případě ultra měkkých heterogenních buněk, tkání a gelů je další výzvou překonat adhezní sílu mezi sondou a povrchem vzorku, aby byla zajištěna reprodukovatelná a spolehlivá měření48,49,50.Až donedávna se většina prací na AFM nanoindentaci soustředila na studium mechanického chování biologických buněk, tkání, gelů, hydrogelů a biomolekul pomocí relativně velkých sférických sond, běžně označovaných jako koloidní sondy (CPs)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Tyto hroty mají poloměr 1 až 50 µm a jsou běžně vyrobeny z borosilikátového skla, polymethylmethakrylátu (PMMA), polystyrenu (PS), oxidu křemičitého (SiO2) a diamantu. jako uhlík (DLC).Přestože nanoindentace CP-AFM je často první volbou pro charakterizaci měkkých vzorků, má své vlastní problémy a omezení.Použití velkých kulových špiček o velikosti mikronů zvyšuje celkovou kontaktní plochu špičky se vzorkem a vede k významné ztrátě prostorového rozlišení.U měkkých nehomogenních vzorků, kde se mechanické vlastnosti lokálních prvků mohou výrazně lišit od průměru v širší oblasti, může CP indentace skrýt jakoukoli nehomogenitu vlastností v lokálním měřítku52.Koloidní sondy se typicky vyrábějí připojením koloidních kuliček o velikosti mikronů k bezhrotovým konzolám pomocí epoxidových lepidel.Samotný výrobní proces je zatížen mnoha problémy a může vést k nesrovnalostem v procesu kalibrace sondy.Kromě toho velikost a hmotnost koloidních částic přímo ovlivňuje hlavní kalibrační parametry konzoly, jako je rezonanční frekvence, tuhost pružiny a citlivost na průhyb56,57,58.Běžně používané metody pro konvenční AFM sondy, jako je kalibrace teploty, tedy nemusejí poskytovat přesnou kalibraci pro CP a k provedení těchto korekcí mohou být vyžadovány jiné metody57, 59, 60, 61. Typické experimenty s indentací CP používají velké odchylky k převýšení. studovat vlastnosti měkkých vzorků, což vytváří další problém při kalibraci nelineárního chování konzoly při relativně velkých odchylkách62,63,64.Moderní metody indentace koloidní sondy obvykle berou v úvahu geometrii konzoly použité ke kalibraci sondy, ale ignorují vliv koloidních částic, což vytváří další nejistotu v přesnosti metody38,61.Podobně moduly pružnosti vypočítané přizpůsobením kontaktního modelu jsou přímo závislé na geometrii vtlačovací sondy a nesoulad mezi charakteristikami povrchu hrotu a vzorku může vést k nepřesnostem27, 65, 66, 67, 68. Některé nedávné práce Spencera et al.Jsou zdůrazněny faktory, které je třeba vzít v úvahu při charakterizaci měkkých polymerových kartáčů pomocí nanoindentační metody CP-AFM.Uvedli, že zadržování viskózní tekutiny v polymerových kartáčích jako funkce rychlosti má za následek zvýšení zatížení hlavy, a tudíž různá měření vlastností závislých na rychlosti30,69,70,71.
V této studii jsme charakterizovali povrchový modul ultraměkkého vysoce elastického materiálu lehfilcon A CL pomocí modifikované nanoindentační metody AFM.Vzhledem k vlastnostem a nové struktuře tohoto materiálu je rozsah citlivosti tradiční indentační metody jednoznačně nedostatečný pro charakterizaci modulu tohoto extrémně měkkého materiálu, proto je nutné použít AFM nanoindentační metodu s vyšší citlivostí a nižší citlivostí.úroveň.Po přezkoumání nedostatků a problémů stávajících nanoindentačních technik koloidní AFM sondy ukážeme, proč jsme zvolili menší, na zakázku navrženou AFM sondu pro eliminaci citlivosti, šumu pozadí, přesného bodu kontaktu, měření modulů rychlosti měkkých heterogenních materiálů, jako je retence tekutin. závislost.a přesné vyčíslení.Kromě toho jsme byli schopni přesně změřit tvar a rozměry hrotu vtisku, což nám umožnilo použít model kužele-koule k určení modulu pružnosti bez posouzení kontaktní plochy hrotu s materiálem.Dva implicitní předpoklady, které jsou v této práci kvantifikovány, jsou plně elastické materiálové vlastnosti a modul nezávislý na hloubce vtisku.Pomocí této metody jsme nejprve testovali ultraměkké standardy se známým modulem pro kvantifikaci metody a poté jsme tuto metodu použili k charakterizaci povrchů dvou různých materiálů kontaktních čoček.Očekává se, že tato metoda charakterizace AFM nanoindentačních povrchů se zvýšenou citlivostí bude aplikovatelná na širokou škálu biomimetických heterogenních ultraměkkých materiálů s potenciálním využitím v lékařských zařízeních a biomedicínských aplikacích.
Pro nanoindentační experimenty byly vybrány kontaktní čočky Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, USA) a jejich silikon-hydrogelové substráty.V experimentu byl použit speciálně navržený držák objektivu.Aby bylo možné čočku nainstalovat za účelem testování, byla opatrně umístěna na kopulovitý stojan, aby se dovnitř nedostaly žádné vzduchové bubliny, a poté byla upevněna pomocí okrajů.Otvor v upínači v horní části držáku čočky poskytuje přístup k optickému středu čočky pro experimenty s nanoindentací, zatímco drží kapalinu na místě.To udržuje čočky plně hydratované.Jako testovací roztok bylo použito 500 μl roztoku na balení kontaktních čoček.Pro ověření kvantitativních výsledků byly komerčně dostupné neaktivované polyakrylamidové (PAAM) hydrogely připraveny z polyakrylamid-co-methylen-bisakrylamidové kompozice (100 mm Petrisoft Petriho misky, Matrigen, Irvine, CA, USA), známý modul pružnosti 1 kPa.Použijte 4-5 kapek (přibližně 125 µl) fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS od Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, USA) a 1 kapku roztoku na kontaktní čočky OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, USA).) na rozhraní AFM hydrogel-sonda.
Vzorky substrátů Lehfilcon A CL a SiHy byly vizualizovány pomocí systému FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) vybaveného detektorem Scanning Transmission Electron Microscope (STEM).Pro přípravu vzorků byly čočky nejprve omyty vodou a nakrájeny na klínky ve tvaru koláče.Pro dosažení rozdílného kontrastu mezi hydrofilní a hydrofobní složkou vzorků byl jako barvivo použit 0,10% stabilizovaný roztok RuO4, ve kterém byly vzorky ponořeny na 30 min.Barvení lehfilcon A CL RuO4 je důležité nejen pro dosažení zlepšeného diferenciálního kontrastu, ale také pomáhá zachovat strukturu rozvětvených polymerových štětců v jejich původní podobě, které jsou pak viditelné na snímcích STEM.Poté byly promyty a dehydratovány v sérii směsí ethanol/voda se zvyšující se koncentrací ethanolu.Vzorky byly poté odlity s EMBed 812/Araldite epoxidem, který vytvrzoval přes noc při 70 °C.Bloky vzorků získané polymerací pryskyřice byly nařezány ultramikrotomem a výsledné tenké řezy byly vizualizovány pomocí STEM detektoru v režimu nízkého vakua při urychlovacím napětí 30 kV.Stejný systém SEM byl použit pro detailní charakterizaci sondy PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA).SEM snímky sondy AFM byly získány v typickém režimu vysokého vakua s urychlovacím napětím 30 kV.Pořizujte snímky v různých úhlech a zvětšeních, abyste zaznamenali všechny detaily tvaru a velikosti hrotu sondy AFM.Všechny rozměry hrotu, které byly předmětem zájmu na obrázcích, byly měřeny digitálně.
Mikroskop atomové síly Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) s režimem „PeakForce QNM in Fluid“ byl použit pro vizualizaci a nanoindentaci vzorků lehfilcon A CL, substrátu SiHy a hydrogelu PAAm.Pro zobrazovací experimenty byla použita sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) s nominálním poloměrem hrotu 1 nm k zachycení obrázků s vysokým rozlišením vzorku při rychlosti skenování 0,50 Hz.Všechny snímky byly pořízeny ve vodném roztoku.
AFM nanoindentační experimenty byly provedeny pomocí sondy PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).Sonda AFM má křemíkový hrot na nitridovém výložníku o tloušťce 345 nm, délce 54 µm a šířce 4,5 µm s rezonanční frekvencí 45 kHz.Je speciálně navržen tak, aby charakterizoval a prováděl kvantitativní nanomechanická měření na měkkých biologických vzorcích.Senzory jsou individuálně kalibrovány ve výrobě s předkalibrovaným nastavením pružiny.Pružinové konstanty sond použitých v této studii byly v rozmezí 0,05–0,1 N/m.Pro přesné určení tvaru a velikosti hrotu byla sonda podrobně charakterizována pomocí SEM.Na Obr.Obrázek la ukazuje skenovací elektronový mikrosnímek s vysokým rozlišením a malým zvětšením sondy PFQNM-LC-A-CAL, který poskytuje holistický pohled na design sondy.Na Obr.lb znázorňuje zvětšený pohled na horní část hrotu sondy, poskytující informace o tvaru a velikosti hrotu.Na krajním konci je jehla polokoule o průměru asi 140 nm (obr. 1c).Pod tím se hrot zužuje do kuželovitého tvaru a dosahuje naměřené délky přibližně 500 nm.Vně zužující se oblasti je hrot válcový a končí v celkové délce hrotu 1,18 µm.Toto je hlavní funkční část hrotu sondy.Kromě toho byla pro testování jako koloidní sonda použita také velká kulovitá polystyrenová (PS) sonda (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, USA) s průměrem hrotu 45 µm a pružinovou konstantou 2 N/m.se sondou PFQNM-LC-A-CAL 140 nm pro srovnání.
Bylo hlášeno, že kapalina může být zachycena mezi sondou AFM a strukturou polymerního kartáčku během nanoindentace, což bude vyvíjet sílu směrem nahoru na sondu AFM předtím, než se skutečně dotkne povrchu69.Tento efekt viskózního vytlačování v důsledku zadržování tekutin může změnit zdánlivý bod kontaktu, a tím ovlivnit měření povrchového modulu.Pro studium vlivu geometrie sondy a rychlosti vtlačování na zadržování tekutin byly vyneseny křivky síly vtlačování pro vzorky lehfilcon A CL za použití sondy o průměru 140 nm při konstantních rychlostech posunu 1 um/sa 2 um/s.průměr sondy 45 µm, pevné nastavení síly 6 nN dosažené při 1 µm/s.Experimenty se sondou o průměru 140 nm byly prováděny při rychlosti vtlačování 1 µm/sa nastavené síle 300 pN, zvolené pro vytvoření kontaktního tlaku ve fyziologickém rozsahu (1–8 kPa) horního víčka.tlak 72. Měkké hotové vzorky hydrogelu PAA o tlaku 1 kPa byly testovány na vtlačovací sílu 50 pN při rychlosti 1 μm/s pomocí sondy o průměru 140 nm.
Vzhledem k tomu, že délka kónické části hrotu sondy PFQNM-LC-A-CAL je přibližně 500 nm, lze pro jakoukoli hloubku vtisku < 500 nm bezpečně předpokládat, že geometrie sondy během indentace zůstane věrná svému kuželový tvar.Kromě toho se předpokládá, že povrch testovaného materiálu bude vykazovat reverzibilní elastickou odezvu, což bude také potvrzeno v následujících částech.Proto jsme v závislosti na tvaru a velikosti hrotu zvolili pro zpracování našich AFM nanoindentačních experimentů (NanoScope) model kužele-koule vyvinutý Briscoe, Sebastianem a Adamsem, který je dostupný v softwaru dodavatele.Software pro analýzu dat separace, Bruker) 73. Model popisuje vztah síla-posunutí F(δ) pro kužel s defektem sférického vrcholu.Na Obr.Obrázek 2 ukazuje kontaktní geometrii během interakce tuhého kužele s kulovým hrotem, kde R je poloměr kulového hrotu, a je kontaktní poloměr, b je kontaktní poloměr na konci kulového hrotu, δ je kontaktní rádius.hloubka vtisku, θ je poloviční úhel kužele.SEM snímek této sondy jasně ukazuje, že kulový hrot o průměru 140 nm přechází tangenciálně do kužele, takže zde b je definováno pouze prostřednictvím R, tj. b = R cos θ.Software dodaný dodavatelem poskytuje vztah kužel-koule pro výpočet hodnot Youngova modulu (E) z údajů o separaci sil za předpokladu a > b.Vztah:
kde F je vtlačovací síla, E je Youngův modul, ν je Poissonův poměr.Kontaktní poloměr a lze odhadnout pomocí:
Schéma kontaktní geometrie tuhého kužele s kulovou špičkou zalisovanou do materiálu kontaktní čočky Lefilcon s povrchovou vrstvou rozvětvených polymerových kartáčků.
Jestliže a ≤ b, vztah se redukuje na rovnici pro konvenční kulový indentor;
Domníváme se, že interakce vtlačovací sondy s rozvětvenou strukturou PMPC polymerového kartáčku způsobí, že kontaktní rádius a bude větší než sférický kontaktní rádius b.Proto jsme pro všechna kvantitativní měření modulu pružnosti provedená v této studii použili závislost získanou pro případ a > b.
Ultraměkké biomimetické materiály studované v této studii byly komplexně zobrazeny pomocí rastrovací transmisní elektronové mikroskopie (STEM) průřezu vzorku a mikroskopie atomárních sil (AFM) povrchu.Tato podrobná charakterizace povrchu byla provedena jako rozšíření naší dříve publikované práce, ve které jsme určili, že dynamicky rozvětvená polymerní kartáčková struktura povrchu lehfilcon A CL modifikovaného PMPC vykazovala podobné mechanické vlastnosti jako nativní rohovková tkáň 14 .Z tohoto důvodu označujeme povrchy kontaktních čoček jako biomimetické materiály14.Na Obr.3a, b znázorňují příčné řezy rozvětvenými PMPC polymerními kartáčovými strukturami na povrchu lehfilcon A CL substrátu a neošetřeného SiHy substrátu.Povrchy obou vzorků byly dále analyzovány pomocí AFM snímků s vysokým rozlišením, což dále potvrdilo výsledky STEM analýzy (obr. 3c, d).Dohromady tyto obrázky poskytují přibližnou délku struktury rozvětveného polymerního kartáčku PMPC při 300–400 nm, což je rozhodující pro interpretaci nanoindentačních měření AFM.Dalším klíčovým pozorováním odvozeným z obrázků je, že celková povrchová struktura biomimetického materiálu CL je morfologicky odlišná od struktury substrátu SiHy.Tento rozdíl v jejich povrchové morfologii se může projevit při jejich mechanické interakci s indentační AFM sondou a následně v naměřených hodnotách modulu.
Průřezové STEM obrazy (a) lehfilcon A CL a (b) SiHy substrátu.Měřítko, 500 nm.AFM snímky povrchu substrátu lehfilcon A CL (c) a základního substrátu SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Bioinspirované polymery a struktury polymerních kartáčků jsou ze své podstaty měkké a byly široce studovány a používány v různých biomedicínských aplikacích74,75,76,77.Proto je důležité používat nanoindentační metodu AFM, která dokáže přesně a spolehlivě změřit jejich mechanické vlastnosti.Ale zároveň jedinečné vlastnosti těchto ultraměkkých materiálů, jako je extrémně nízký modul pružnosti, vysoký obsah kapaliny a vysoká elasticita, často ztěžují výběr správného materiálu, tvaru a tvaru vtlačovací sondy.velikost.To je důležité, aby indentor neprorazil měkký povrch vzorku, což by vedlo k chybám při určování bodu kontaktu s povrchem a oblasti kontaktu.
K tomu je nezbytné komplexní pochopení morfologie ultra měkkých biomimetických materiálů (lehfilcon A CL).Informace o velikosti a struktuře rozvětvených polymerních kartáčků získané pomocí zobrazovací metody poskytují základ pro mechanickou charakterizaci povrchu pomocí nanoindentačních technik AFM.Místo sférických koloidních sond o velikosti mikronů jsme zvolili sondu z nitridu křemíku PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) s průměrem hrotu 140 nm, speciálně navrženou pro kvantitativní mapování mechanických vlastností biologických vzorků 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 Důvod pro použití relativně ostrých sond ve srovnání s konvenčními koloidními sondami lze vysvětlit strukturálními vlastnostmi materiálu.Porovnáním velikosti hrotu sondy (~140 nm) s rozvětvenými polymerovými kartáčky na povrchu CL lehfilcon A, znázorněnými na obr. 3a, lze dojít k závěru, že hrot je dostatečně velký na to, aby se dostal do přímého kontaktu s těmito strukturami kartáčků, které snižuje možnost proražení hrotu skrz ně.Pro ilustraci tohoto bodu, na obr. 4 je STEM obraz lehfilconu A CL a odsazený hrot AFM sondy (nakreslený v měřítku).
Schéma zobrazující STEM snímek lehfilconu A CL a indentační sondu ACM (nakresleno v měřítku).
Kromě toho je velikost hrotu 140 nm dostatečně malá, aby se zabránilo riziku jakýchkoli lepkavých vytlačovacích efektů dříve uváděných pro polymerové kartáče vyráběné nanoindentační metodou CP-AFM69,71.Předpokládáme, že vzhledem ke speciálnímu kuželovo-kulovitému tvaru a relativně malé velikosti tohoto AFM hrotu (obr. 1) nebude povaha silokřivky generované nanoindentací lehfilcon A CL záviset na rychlosti vtlačování nebo rychlosti nakládání/vykládání .Není tedy ovlivněn poroelastickými účinky.Pro testování této hypotézy byly vzorky lehfilcon A CL odsazeny při pevné maximální síle pomocí sondy PFQNM-LC-A-CAL, ale při dvou různých rychlostech, a výsledné křivky tahové a zatahovací síly byly použity k vynesení síly (nN) v separaci (µm) je znázorněno na obrázku 5a.Je zřejmé, že silokřivky během nakládání a vykládání se zcela překrývají a neexistuje žádný jasný důkaz, že by se silový smyk při nulové hloubce vtisku na obrázku zvětšoval s rychlostí vtisku, což naznačuje, že jednotlivé prvky kartáče byly charakterizovány bez poroelastického efektu.Naproti tomu efekty zadržování tekutin (viskózní extruze a efekty poroelasticity) jsou evidentní pro sondu AFM o průměru 45 um při stejné rychlosti vtlačování a jsou zvýrazněny hysterezí mezi natahovacími a zatahovacími křivkami, jak je znázorněno na obrázku 5b.Tyto výsledky podporují hypotézu a naznačují, že sondy o průměru 140 nm jsou dobrou volbou pro charakterizaci takových měkkých povrchů.
lehfilcon A CL indentační silové křivky pomocí ACM;a) použití sondy o průměru 140 nm při dvou rychlostech zatížení, což prokazuje nepřítomnost poroelastického efektu během vtlačování povrchu;(b) použitím sond o průměru 45 um a 140 nm.s ukazují účinky viskózní extruze a poroelasticity pro velké sondy ve srovnání s menšími sondami.
Aby bylo možné charakterizovat ultraměkké povrchy, musí mít nanoindentační metody AFM nejlepší sondu pro studium vlastností studovaného materiálu.Kromě tvaru a velikosti hrotu hraje důležitou roli při určování přesnosti a spolehlivosti nanoindentace citlivost systému detektoru AFM, citlivost na vychýlení hrotu v testovacím prostředí a tuhost konzoly.Měření.Pro náš systém AFM je limit detekce polohově citlivého detektoru (PSD) přibližně 0,5 mV a je založen na předem kalibrované rychlosti pružiny a vypočtené citlivosti na vychýlení tekutiny sondy PFQNM-LC-A-CAL, která odpovídá teoretická citlivost zátěže.je menší než 0,1 pN.Proto tato metoda umožňuje měření minimální vtlačovací síly ≤ 0,1 pN bez jakékoli obvodové hlukové složky.Pro systém AFM je však téměř nemožné snížit periferní hluk na tuto úroveň kvůli faktorům, jako jsou mechanické vibrace a dynamika tekutin.Tyto faktory omezují celkovou citlivost metody nanoindentace AFM a také vedou k signálu šumu pozadí přibližně ≤ 10 pN.Pro charakterizaci povrchu byly vzorky substrátu lehfilcon A CL a SiHy vtlačeny za plně hydratovaných podmínek pomocí 140 nm sondy pro SEM charakterizaci a výsledné silové křivky byly superponovány mezi silou (pN) a tlakem.Separační graf (um) je znázorněn na obrázku 6a.Silová křivka lehfilcon A CL ve srovnání se základním substrátem SiHy jasně ukazuje přechodnou fázi začínající v místě kontaktu s vidlicovým polymerovým kartáčem a končící prudkou změnou kontaktu hrotu s podložním materiálem.Tato přechodná část silové křivky zvýrazňuje skutečně elastické chování rozvětveného polymerového kartáče na povrchu, což dokazuje kompresní křivka těsně sledující křivku napětí a kontrast mechanických vlastností mezi strukturou kartáče a objemným SiHy materiálem.Při srovnání lefilconu.Separace průměrné délky rozvětveného polymerového štětce na STEM snímku PCS (obr. 3a) a jeho silokřivka podél úsečky na obr. 3a.6a ukazuje, že způsob je schopen detekovat špičku a rozvětvený polymer dosahující samého vrcholu povrchu.Kontakt mezi kartáčovými strukturami.Kromě toho těsné překrytí silových křivek neindikuje žádný účinek zadržování kapaliny.V tomto případě neexistuje absolutně žádná adheze mezi jehlou a povrchem vzorku.Nejvyšší úseky silových křivek pro dva vzorky se překrývají, což odráží podobnost mechanických vlastností materiálů substrátu.
(a) AFM nanoindentační silokřivky pro substráty lehfilcon A CL a SiHy substráty, (b) silokřivky ukazující odhad kontaktního bodu pomocí metody prahu šumu pozadí.
Aby bylo možné studovat jemnější detaily křivky síly, je křivka napětí vzorku lehfilcon A CL překreslena na obr. 6b s maximální silou 50 pN podél osy y.Tento graf poskytuje důležité informace o původním šumu na pozadí.Hluk se pohybuje v rozmezí ±10 pN, což slouží k přesnému určení kontaktního bodu a výpočtu hloubky vtisku.Jak je uvedeno v literatuře, identifikace kontaktních bodů je rozhodující pro přesné posouzení vlastností materiálu, jako je modul85.Přístup zahrnující automatické zpracování dat silové křivky ukázal lepší shodu mezi měřením dat a kvantitativními měřeními pro měkké materiály86.V této práci je náš výběr styčných bodů poměrně jednoduchý a objektivní, má však svá omezení.Náš konzervativní přístup k určování bodu kontaktu může vést k mírně nadhodnoceným hodnotám modulu pro menší hloubky vtisku (< 100 nm).Použití detekce dotykových bodů na základě algoritmu a automatizované zpracování dat by mohlo být pokračováním této práce v budoucnu za účelem dalšího zlepšení naší metody.Pro vlastní šum pozadí v řádu ±10 pN tedy definujeme kontaktní bod jako první datový bod na ose x na obrázku 6b s hodnotou ≥10 pN.Poté, v souladu s prahovou hodnotou šumu 10 pN, svislá čára na úrovni ~0,27 µm označuje bod kontaktu s povrchem, po kterém křivka natahování pokračuje, dokud substrát nedosáhne hloubky vtisku ~270 nm.Zajímavé je, že na základě velikosti prvků rozvětveného polymerového kartáčku (300–400 nm) měřené pomocí zobrazovací metody je hloubka vtisku vzorku CL lehfilcon A pozorovaná pomocí metody prahu šumu pozadí asi 270 nm, což je velmi blízko velikost měření pomocí STEM.Tyto výsledky dále potvrzují kompatibilitu a použitelnost tvaru a velikosti hrotu sondy AFM pro indentaci této velmi měkké a vysoce elastické struktury rozvětveného polymerového kartáčku.Tato data také poskytují silný důkaz na podporu naší metody použití šumu na pozadí jako prahové hodnoty pro přesné určení kontaktních bodů.Jakékoli kvantitativní výsledky získané z matematického modelování a prokládání silokřivek by tedy měly být relativně přesné.
Kvantitativní měření nanoindentačními metodami AFM jsou zcela závislá na matematických modelech použitých pro výběr dat a následnou analýzu.Proto je důležité před výběrem konkrétního modelu zvážit všechny faktory související s výběrem indentoru, materiálovými vlastnostmi a mechanikou jejich vzájemného působení.V tomto případě byla geometrie hrotu pečlivě charakterizována pomocí mikrografů SEM (obr. 1) a na základě výsledků je nanoindentační sonda AFM o průměru 140 nm s tvrdým kuželem a kulovou geometrií hrotu dobrou volbou pro charakterizaci vzorků lehfilcon A CL79 .Dalším důležitým faktorem, který je třeba pečlivě vyhodnotit, je elasticita testovaného polymerního materiálu.Přestože počáteční data nanoindentace (obr. 5a a 6a) jasně nastiňují rysy překrývání křivek tahu a tlaku, tj. úplné elastické zotavení materiálu, je nesmírně důležité potvrdit čistě elastickou povahu kontaktů .Za tímto účelem byly provedeny dvě po sobě jdoucí vtisky na stejném místě na povrchu vzorku lehfilcon A CL při rychlosti vtlačování 1 um/s za podmínek plné hydratace.Výsledná data silové křivky jsou znázorněna na Obr.7 a jak se očekávalo, expanzní a kompresní křivky obou tisků jsou téměř totožné, což zvýrazňuje vysokou elasticitu struktury rozvětveného polymerového kartáče.
Dvě křivky vtlačovací síly na stejném místě na povrchu lehfilcon A CL ukazují ideální elasticitu povrchu čočky.
Na základě informací získaných ze snímků SEM a STEM hrotu sondy a povrchu lehfilcon A CL, v tomto pořadí, je model kuželové koule rozumnou matematickou reprezentací interakce mezi hrotem sondy AFM a testovaným měkkým polymerním materiálem.Navíc pro tento model kužele-koule platí základní předpoklady o elastických vlastnostech otištěného materiálu pro tento nový biomimetický materiál a používají se ke kvantifikaci modulu pružnosti.
Po komplexním vyhodnocení nanoindentační metody AFM a jejích komponent, včetně vlastností vtlačovací sondy (tvar, velikost a tuhost pružiny), citlivosti (odhad šumu pozadí a kontaktního bodu) a datových modelů (kvantitativní měření modulu), byla metoda použitý.charakterizovat komerčně dostupné ultraměkké vzorky pro ověření kvantitativních výsledků.Komerční polyakrylamidový (PAAM) hydrogel s modulem pružnosti 1 kPa byl testován za hydratovaných podmínek pomocí 140 nm sondy.Podrobnosti o testování modulu a výpočtech jsou uvedeny v doplňkových informacích.Výsledky ukázaly, že průměrný naměřený modul byl 0,92 kPa a % RSD a procentuální (%) odchylka od známého modulu byly menší než 10 %.Tyto výsledky potvrzují přesnost a reprodukovatelnost metody nanoindentace AFM použité v této práci k měření modulů ultraměkkých materiálů.Povrchy vzorků lehfilcon A CL a SiHy základního substrátu byly dále charakterizovány pomocí stejné nanoindentační metody AFM pro studium zdánlivého kontaktního modulu ultraměkkého povrchu jako funkce hloubky vtisku.Separační křivky síly vtisku byly vytvořeny pro tři vzorky každého typu (n = 3; jeden vtisk na vzorek) při síle 300 pN, rychlosti 1 µm/s a plné hydrataci.Křivka sdílení indentační síly byla aproximována pomocí modelu kužel-koule.Pro získání modulu závislého na hloubce vtisku byla nastavena 40 nm široká část silokřivky při každém přírůstku 20 nm počínaje bodem kontaktu a naměřeny hodnoty modulu v každém kroku silokřivky.Spin Cy a kol.Podobný přístup byl použit pro charakterizaci gradientu modulu poly(laurylmethakrylátových) (P12MA) polymerových kartáčů pomocí koloidní nanoindentace sondou AFM a jsou v souladu s daty využívajícími Hertzův kontaktní model.Tento přístup poskytuje graf zdánlivého kontaktního modulu (kPa) versus hloubka vtisku (nm), jak je znázorněno na obrázku 8, který ilustruje gradient zdánlivý kontaktní modul/hloubka.Vypočtený modul pružnosti vzorku CL lehfilcon A je v rozmezí 2–3 kPa v rámci horních 100 nm vzorku, za kterým se začíná s hloubkou zvětšovat.Na druhou stranu, při testování SiHy základního substrátu bez kartáčovitého filmu na povrchu je maximální hloubka vtisku dosažená při síle 300 pN menší než 50 nm a hodnota modulu získaná z dat je asi 400 kPa. , který je srovnatelný s hodnotami Youngova modulu pro sypké materiály.
Zdánlivý kontaktní modul (kPa) vs. hloubka vtisku (nm) pro substráty lehfilcon A CL a SiHy pomocí metody nanoindentace AFM s geometrií kužele-koule k měření modulu.
Nejvyšší povrch nové struktury biomimetického rozvětveného polymerního kartáčku vykazuje extrémně nízký modul pružnosti (2–3 kPa).To bude odpovídat volně visícímu konci vidlicového polymerového kartáče, jak je znázorněno na obrázku STEM.Zatímco existují určité důkazy o gradientu modulu na vnějším okraji CL, hlavní substrát s vysokým modulem má větší vliv.Horních 100 nm povrchu je však do 20 % celkové délky rozvětveného polymerového kartáčku, takže je rozumné předpokládat, že naměřené hodnoty modulu v tomto rozsahu hloubky vtisku jsou relativně přesné a nejsou příliš silné. závisí na účinku spodního předmětu.
Vzhledem k unikátní biomimetické konstrukci kontaktních čoček lehfilcon A, sestávajících z rozvětvených PMPC polymerních kartáčových struktur naroubovaných na povrch SiHy substrátů, je velmi obtížné spolehlivě charakterizovat mechanické vlastnosti jejich povrchových struktur pomocí tradičních metod měření.Zde představujeme pokročilou metodu nanoindentace AFM pro přesnou charakterizaci ultra měkkých materiálů, jako je lefilcon A s vysokým obsahem vody a extrémně vysokou elasticitou.Tato metoda je založena na použití AFM sondy, jejíž velikost hrotu a geometrie jsou pečlivě zvoleny tak, aby odpovídaly strukturálním rozměrům ultraměkkých povrchových prvků, které mají být otištěny.Tato kombinace rozměrů mezi sondou a strukturou poskytuje zvýšenou citlivost, což nám umožňuje měřit nízký modul a inherentní elastické vlastnosti rozvětvených polymerových kartáčových prvků, bez ohledu na poroelastické efekty.Výsledky ukázaly, že unikátní štětečky z rozvětveného polymeru PMPC charakteristické pro povrch čočky měly extrémně nízký modul pružnosti (až 2 kPa) a velmi vysokou elasticitu (téměř 100 %) při testování ve vodném prostředí.Výsledky nanoindentace AFM nám také umožnily charakterizovat zdánlivý gradient kontaktní modul/hloubka (30 kPa/200 nm) povrchu biomimetické čočky.Tento gradient může být způsoben rozdílem modulu mezi rozvětvenými polymerními kartáči a SiHy substrátem nebo rozvětvenou strukturou/hustotou polymerních kartáčů nebo jejich kombinací.K plnému pochopení vztahu mezi strukturou a vlastnostmi, zejména vlivu větvení kartáčů na mechanické vlastnosti, jsou však zapotřebí další hloubkové studie.Podobná měření mohou pomoci charakterizovat mechanické vlastnosti povrchu jiných ultra měkkých materiálů a lékařských zařízení.
Datové soubory generované a/nebo analyzované během aktuální studie jsou k dispozici od příslušných autorů na odůvodněnou žádost.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. a Haugen, HJ Biologické reakce na fyzikální a chemické vlastnosti povrchů biomateriálů.Chemikálie.společnost.Ed.49, 5178–5224 (2020).
Chen, FM a Liu, X. Zlepšení biomateriálů lidského původu pro tkáňové inženýrství.programování.polymer.věda.53, 86 (2016).
Sadtler, K. a kol.Návrh, klinická implementace a imunitní odpověď biomateriálů v regenerativní medicíně.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK a Farr GM Vylepšená metoda pro stanovení tvrdosti a modulu pružnosti pomocí indentačních experimentů s měřením zatížení a posunu.J. Alma mater.skladovací nádrž.7, 1564–1583 (2011).
Wally, SM Historické počátky testování tvrdosti vtiskem.alma mater.věda.technologií.28, 1028–1044 (2012).
Broitman, E. Měření vtiskové tvrdosti v makro, mikro a nanoměřítku: Kritický přehled.kmen.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD a Clapperich, SM Chyby detekce povrchu vedou k nadhodnocení modulu v nanoindentaci měkkých materiálů.J. Mecha.Chování.Biomedicína.alma mater.2, 312–317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR a Yahya M.Yu.Vyhodnocení metody nanoindentace pro stanovení mechanických charakteristik heterogenních nanokompozitů pomocí experimentálních a výpočetních metod.věda.Dům 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR a Owart, TS Mechanická charakterizace měkkých viskoelastických gelů indentací a optimalizací založenou na inverzní analýze konečných prvků.J. Mecha.Chování.Biomedicína.alma mater.2, 355–363 (2009).
Andrews JW, Bowen J a Chaneler D. Optimalizace stanovení viskoelasticity pomocí kompatibilních měřicích systémů.Soft Matter 9, 5581–5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. a Pellillo, E. Nanoindentace polymerních povrchů.J. Fyzika.D. Přihlaste se na fyziku.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. a Van Vliet KJ Charakterizace viskoelastických mechanických vlastností vysoce elastických polymerů a biologických tkání pomocí rázové indentace.Journal of Biomaterials.71, 388–397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Hodnocení modulu pružnosti a adhezní práce měkkých materiálů pomocí rozšířené Borodich-Galanovovy (BG) metody a hluboké indentace.srst.alma mater.129, 198–213 (2019).
Shi, X. a kol.Morfologie nanoměřítek a mechanické vlastnosti biomimetických polymerních povrchů silikon-hydrogelových kontaktních čoček.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).